Cromatografía
La distribución de un
soluto entre las fases móvil y estacionaria en cromatografía se describe mediante k
, el coeficiente de partición, definido por: 𝑘
κ=Cs/Cm
donde Cs es
la concentración de soluto en la fase estacionaria y Cm es la
concentración del soluto en la fase móvil. La fase móvil sirve para transportar
las moléculas de la muestra a través de la columna cromatográfica. Durante el
transporte de las moléculas de la muestra a través de la columna, cada analito
se retiene de acuerdo con la afinidad característica de ese compuesto por la
fase estacionaria. El tiempo que transcurre entre la inyección de la muestra y
el pico máximo se denomina tiempo de retención. El área debajo de cada pico es
proporcional a la cantidad de analito correspondiente en la solución.
El tiempo de retención, tR,
viene dado en segundos por:
tR=tS+tM
donde tS es el tiempo que pasa
el analito en la fase estacionaria y tM es el tiempo que pasa en la
fase móvil. tM a menudo se denomina tiempo muerto o vacío.
La eficiencia de la columna se ve
afectada por la cantidad de ensanchamiento de la banda que se produce cuando la
muestra pasa a través de la columna. La teoría de la velocidad describe las
formas de los picos en términos cuantitativos y se basa en el número infinito
de caminos que la muestra puede tomar para eluir fuera de la columna. Algunas
moléculas viajarán rápidamente a través de la columna debido a su inclusión
accidental en la fase móvil, mientras que otras moléculas quedarán muy
retrasadas debido a su inclusión accidental en la fase estacionaria. El
resultado de estos efectos es una banda cromatográfica típica de forma
gaussiana con una variación de velocidades alrededor del valor medio. Además,
el ancho del pico aumenta a medida que desciende por la columna debido a la
mayor oportunidad de propagación.
Los dos términos utilizados para medir la
eficiencia de la columna son la altura de los platos, H, y el número de platos,
N. Estos dos términos relacionados por la siguiente ecuación donde L es la
longitud de la columna:
N=L/H
Una mayor eficiencia de la columna se
caracteriza por un gran número de platos N y una pequeña altura de platos H.
Tanto H como N se pueden determinar experimentalmente utilizando las dos
ecuaciones siguientes:
H=LW2/16(tR)2
N=16(tR/W)2
donde L es la longitud del empaque de la
columna, W es el ancho de la magnitud de la base del triángulo y tR es el tiempo de retención del analito.
Utilizando la teoría del ensanchamiento de banda, la eficiencia de las columnas
cromatográficas se puede aproximar mediante tR de la ecuación
de van Deemter
H=A + B/m + CS m+CM m
donde H es la altura de los platos en
centímetros y m es la velocidad lineal de la fase móvil en centímetros por
segundo. El término A describe el efecto de trayectoria múltiple, o difusión en
remolino, B describe el coeficiente de difusión longitudinal y CS m y CM m son los coeficientes de transferencia de masa
para los sistemas estacionario y móvil, respectivamente.
Los factores de selectividad y capacidad se pueden controlar
mejorando la separación, como cambiando la composición de la fase
móvil/estacionaria, la temperatura de la columna
Cromatografía gaseosa
a cromatografía de gases es un término utilizado para
describir el grupo de técnicas de separación analítica utilizadas para analizar
sustancias volátiles en fase gaseosa. En la cromatografía de gases, los
componentes de una muestra se disuelven en un disolvente y se vaporizan para
separar los analitos distribuyendo la muestra en dos fases: una fase
estacionaria y una fase móvil. La fase móvil es un gas químicamente inerte que
sirve para transportar las moléculas del analito a través de la columna
calentada. La cromatografía de gases es una de las únicas formas de cromatografía
que no utiliza la fase móvil para interactuar con el analito. La fase
estacionaria es un adsorbente sólido, denominado cromatografía gas-sólido
(GSC), o un líquido sobre un soporte inerte, denominado cromatografía
gas-líquido (GLC).
A principios de 1900, Mikhail Semenovich Tsvett descubrió
la cromatografía de gases (GC) como una técnica de separación para separar
compuestos. En química orgánica, la cromatografía en columna líquido-sólido se
utiliza a menudo para separar compuestos orgánicos en solución. Entre los
distintos tipos de cromatografía de gases, la cromatografía gas-líquido es el
método más utilizado para separar compuestos orgánicos. La combinación de
cromatografía de gases y espectrometría de masas es una herramienta invaluable
en la identificación de moléculas. Un cromatógrafo de gases típico consta de un
puerto de inyección, una columna, equipo de control del flujo de gas portador,
hornos y calentadores para mantener las temperaturas del puerto de inyección y
de la columna, un registrador gráfico integrador y un detector.
Para separar los compuestos en la cromatografía
gas-líquido, se inyecta una muestra de solución que contiene compuestos
orgánicos de interés en el puerto de muestra donde se vaporizará. Las muestras
vaporizadas que se inyectan son luego transportadas por un gas inerte, que a
menudo se utiliza como helio o nitrógeno. Este gas inerte pasa a través de una
columna de vidrio llena de sílice recubierta con un líquido. Los materiales que
son menos solubles en el líquido aumentarán el resultado más rápido que el
material con mayor solubilidad. El propósito de este módulo es proporcionar una
mejor comprensión sobre sus técnicas de separación y medición y su aplicación.
En GLC, la fase estacionaria líquida se adsorbe en un
empaque sólido inerte o se inmoviliza en las paredes del tubo capilar. La
columna se considera empacada si los tubos de la columna de vidrio o metal
están llenos de pequeños soportes esféricos inertes. La fase líquida se adsorbe
sobre la superficie de estas perlas en una capa fina. En una columna capilar,
las paredes del tubo están recubiertas con la fase estacionaria o una capa
adsorbente, que es capaz de soportar la fase líquida. Sin embargo, el método de
GSC tiene una aplicación limitada en el laboratorio y rara vez se utiliza
debido a la intensa cola de pico y la retención semipermanente de compuestos
polares dentro de la columna. Por lo tanto, el método de cromatografía
gas-líquido simplemente se abrevia a cromatografía de gases y se denominará
como tal aquí. El propósito de este módulo es proporcionar una mejor
comprensión de sus técnicas de separación y medición y su aplicación.
-Inyección de muestra
Es necesario un puerto de muestra para introducir la
muestra en la cabeza de la columna. Las técnicas de inyección modernas a menudo
emplean el uso de puertos de muestra calentados a través de los cuales la
muestra puede inyectarse y vaporizarse casi simultáneamente. Se utiliza una
microjeringa calibrada para administrar un volumen de muestra en el rango de
unos pocos microlitros a través de un tabique de goma y dentro de la cámara de
vaporización. La mayoría de las separaciones requieren solo una pequeña fracción
del volumen de muestra inicial y se utiliza un divisor de muestra para dirigir
el exceso de muestra al desperdicio. Los cromatógrafos de gases comerciales a
menudo permiten inyecciones divididas y sin división cuando se alternan entre
columnas empaquetadas y columnas capilares. La cámara de vaporización
normalmente se calienta 50 °C por encima del punto de ebullición más bajo de la
muestra y posteriormente se mezcla con el gas portador para transportar la
muestra a la columna, en la figura 1 se muestra un esquema de un inyector.
-Gas
portador
El gas
portador juega un papel importante y varía según el GC utilizado. El gas
portador debe estar seco, libre de oxígeno y ser la fase móvil químicamente
inerte empleada en cromatografía de gases. El helio se utiliza más comúnmente
porque es más seguro que el hidrógeno, pero comparable en eficiencia, tiene un
rango más amplio de caudales y es compatible con muchos detectores. También se
utilizan nitrógeno, argón e hidrógeno según el rendimiento deseado y el
detector que se utilice. Tanto el hidrógeno como el helio, que se utilizan
comúnmente en la mayoría de los detectores tradicionales, como los de
ionización de llama (FID), conductividad térmica (TCD) y captura de electrones
(ECD), proporcionan un tiempo de análisis más corto y temperaturas de elución más
bajas de la muestra debido a velocidades de flujo más altas. y bajo peso
molecular. Por ejemplo, el hidrógeno o el helio como gas portador dan la mayor
sensibilidad con TCD porque la diferencia en la conductividad térmica entre el
vapor orgánico y el hidrógeno/helio es mayor que la de otros gases portadores.
Otros detectores, como la espectroscopia de masas, utilizan nitrógeno o argón,
que tienen una ventaja mucho mayor que el hidrógeno o el helio debido a sus
pesos moleculares más altos, lo que mejora la eficiencia de la bomba de vacío.
Todos
los gases portadores están disponibles en tanques presurizados y se utilizan reguladores
de presión, manómetros y medidores de flujo para controlar meticulosamente el
caudal del gas. La mayoría de los suministros de gas utilizados deben estar
entre el 99,995 % y el 99,9995 % de pureza y contener niveles bajos (< 0,5
ppm) de oxígeno e hidrocarburos totales en el tanque. El sistema de gas
portador contiene un tamiz molecular para eliminar el agua y otras impurezas.
Las trampas son otra opción para mantener el sistema puro y con una
sensibilidad óptima y eliminar restos de agua y otros contaminantes. Se
requiere una regulación de presión de dos etapas para minimizar los aumentos
repentinos de presión y controlar el caudal del gas. Para monitorear el caudal
del gas también se requirió un regulador de flujo o presión tanto en el tanque como
en la entrada de gas del cromatógrafo. Esto se aplica a diferentes tipos de gas
que utilizarán diferentes tipos de regulador. El gas portador se precalienta y
se filtra con un tamiz molecular para eliminar las impurezas y el agua antes de
introducirlo en la cámara de vaporización. Normalmente se requiere un gas
portador en el sistema GC para fluir a través del inyector y empujar los
componentes gaseosos de la muestra hacia la columna del GC, que conduce al
detector, en la tabla 1 y 2 se muestra gases recomendados como gas portador.
Tabla
1 Gas
recomendado para columnas capilares
Tabla
2. Gas
recomendado para columnas empaquetadas
-Horno
de la columna
El
horno termostatizado sirve para controlar la temperatura de la columna en unas
décimas de grado para realizar un trabajo preciso. El horno se puede operar de
dos maneras: programación isotérmica o programación de temperatura. En la
programación isotérmica, la temperatura de la columna se mantiene constante
durante toda la separación. La temperatura óptima de la columna para
funcionamiento isotérmico es aproximadamente el punto medio del rango de
ebullición de la muestra. Sin embargo, la programación isotérmica funciona
mejor sólo si el rango del punto de ebullición de la muestra es estrecho. Si se
utiliza una temperatura de columna isotérmica baja con un amplio intervalo de
puntos de ebullición, las fracciones de bajo punto de ebullición se resuelven
bien, pero las fracciones de alto punto de ebullición tardan en eluir con un
amplio ensanchamiento de banda. Si la temperatura se aumenta más cerca de los
puntos de ebullición de los componentes de mayor punto de ebullición, los
componentes de mayor punto de ebullición eluyen como picos agudos, pero los
componentes de menor punto de ebullición eluyen tan rápidamente que no hay
separación.
En el
método de programación de temperatura, la temperatura de la columna aumenta
continuamente o en pasos a medida que avanza la separación. Este método es muy
adecuado para separar una mezcla con un amplio rango de puntos de ebullición.
El análisis comienza a baja temperatura para resolver los componentes de bajo
punto de ebullición y aumenta durante la separación para resolver los
componentes menos volátiles y de alto punto de ebullición de la muestra. Las
velocidades de 5-7 °C/minuto son típicas para las separaciones con programación
de temperatura, en la figura 2 se muestra el efecto que tiene la temperatura
sobre los picos.
Figura 2: El efecto de la temperatura de la columna sobre la forma de los picos.
-Columnas
tubulares abiertas y columnas empaquetadas
Las
columnas tubulares abiertas, también conocidas como columnas capilares, se
presentan en dos formas básicas. La primera es una columna tubular abierta
revestida de pared (WCOT) y el segundo tipo es una columna tubular abierta
revestida de soporte (SCOT). Las columnas WCOT son tubos capilares que tienen
una fina capa de fase estacionaria recubierta a lo largo de las paredes de la
columna. En las columnas SCOT, las paredes de la columna se recubren primero
con una capa delgada (de unos 30 micrómetros de espesor) de un sólido
adsorbente, como tierra de diatomeas, un material que consiste en esqueletos
unicelulares de plantas marinas. Luego se trata el sólido adsorbente con la
fase estacionaria líquida. Si bien las columnas SCOT son capaces de contener un
mayor volumen de fase estacionaria que una columna WCOT debido a su mayor
capacidad de muestra, las columnas WCOT aún tienen mayores eficiencias de
columna.
La
mayoría de las columnas WCOT modernas están hechas de vidrio, pero también se
han utilizado acero inoxidable T316, aluminio, cobre y plásticos. Cada material
tiene sus propios méritos relativos según la aplicación. Las columnas WCOT de
vidrio tienen la clara ventaja del grabado químico, que generalmente se logra
mediante un tratamiento con ácido clorhídrico concentrado o gaseoso. El proceso
de grabado le da al vidrio una superficie rugosa y permite que la fase
estacionaria adherida se adhiera más firmemente a la superficie de la columna.
-Sistemas
de detección
El
detector es el dispositivo situado al final de la columna que proporciona una
medición cuantitativa de los componentes de la mezcla a medida que eluyen en
combinación con el gas portador. En teoría, cualquier propiedad de la mezcla
gaseosa que sea diferente del gas portador puede utilizarse como método de
detección. Estas propiedades de detección se dividen en dos categorías:
propiedades masivas y propiedades específicas. Las propiedades en masa, que
también se conocen como propiedades generales, son propiedades que poseen tanto
el gas portador como el analito, pero en diferentes grados. Propiedades
específicas, como los detectores que miden el contenido de nitrógeno y fósforo,
tienen aplicaciones limitadas, pero lo compensan con su mayor sensibilidad.
Cada
detector tiene dos partes principales que, cuando se usan juntas, sirven como
transductores para convertir los cambios de propiedad detectados en una señal
eléctrica que se registra como un cromatograma. La primera parte del detector
es el sensor que se coloca lo más cerca posible de la salida de la columna para
optimizar la detección. El segundo es el equipo electrónico utilizado para
digitalizar la señal analógica para que una computadora pueda analizar el
cromatograma adquirido. Cuanto antes se convierta la señal analógica en
digital, mayor será la relación señal-ruido, ya que las señales analógicas son
fácilmente susceptibles a muchos tipos de interferencias.
Un
detector de GC ideal se distingue por varias características. El primer
requisito es una sensibilidad adecuada para proporcionar una señal de alta
resolución para todos los componentes de la mezcla. Esta es claramente una
afirmación idealizada, ya que dicha muestra se acercaría al volumen cero y el
detector necesitaría una sensibilidad infinita para detectarla. En los
instrumentos modernos, la sensibilidad de los detectores está en el rango de 10
-8 a 10 -15 g de soluto por segundo. Además, la cantidad de muestra debe ser
reproducible y muchas columnas distorsionarán los picos si no se inyecta
suficiente muestra. Una columna ideal también será químicamente inerte y no
debería alterar la muestra de ninguna manera. Las columnas optimizadas podrán
soportar temperaturas en el rango de -200 °C a al menos 400 °C. Además, dicha
columna tendría un tiempo de respuesta lineal corto que es independiente del
caudal y se extiende por varios órdenes de magnitud. Además, el detector debe
ser fiable, predecible y fácil de utilizar.
-Detectores
de espectrometría de masas
Los
detectores de espectrómetro de masas (MS) son los más potentes de todos los
detectores de cromatografía de gases. En un sistema GC/MS, el espectrómetro de
masas escanea las masas continuamente durante toda la separación. Cuando la
muestra sale de la columna de cromatografía, pasa a través de una línea de transferencia
hacia la entrada del espectrómetro de masas. Luego, la muestra se ioniza y
fragmenta, generalmente mediante una fuente de iones de impacto electrónico.
Durante este proceso, la muestra es bombardeada por electrones energéticos que
ionizan la molécula haciéndole perder un electrón debido a la repulsión
electrostática. Un bombardeo adicional hace que los iones se fragmenten. Luego,
los iones se pasan a un analizador de masas donde se clasifican según su valor
m/z, o relación masa-carga. La mayoría de los iones tienen una sola carga, en
la figura 3 se muestra un ejemplo del espectro de masas del agua.
Figura
3
Espectro de masas del agua
-Detectores
de ionización de llama
Los detectores
de ionización de llama (FID) son los detectores más aplicables y utilizados. En
un FID, la muestra se dirige a una llama de aire-hidrógeno después de salir de
la columna. A la alta temperatura de la llama de aire-hidrógeno, la muestra
sufre pirólisis o descomposición química mediante un calentamiento intenso. Los
hidrocarburos pirolizados liberan iones y electrones que transportan corriente.
Un picoamperímetro de alta impedancia mide esta corriente para controlar la
elución de la muestra, en la figura 4 se muestra un esquema de este detector.
Es
ventajoso utilizar FID porque el detector no se ve afectado por el caudal, los
gases no combustibles y el agua. Estas propiedades permiten al FID alta
sensibilidad y bajo ruido. La unidad es confiable y relativamente fácil de
usar. Sin embargo, esta técnica requiere gas inflamable y también destruye la
muestra.
Figura
4:
Esquema de un detector FID
-Detectores
de conductividad térmica
Los
detectores de conductividad térmica (TCD) fueron uno de los primeros detectores
desarrollados para su uso con cromatografía de gases. El TCD funciona midiendo
el cambio en la conductividad térmica del gas portador causado por la presencia
de la muestra, que tiene una conductividad térmica diferente a la del gas
portador. Su diseño es relativamente simple y consiste en una fuente calentada
eléctricamente que se mantiene a potencia constante. La temperatura de la
fuente depende de las conductividades térmicas de los gases circundantes. La
fuente suele ser un alambre delgado hecho de platino, oro o . La resistencia
dentro del cable depende de la temperatura, que a su vez depende de la
conductividad térmica del gas, en la figura 5 se muestra un esquema de este
detector.
Los
TCD suelen emplear dos detectores, uno de los cuales se utiliza como referencia
para el gas portador y el otro que monitorea la conductividad térmica del gas portador
y la mezcla de muestra. Los gases portadores como el helio y el hidrógeno
tienen conductividades térmicas muy altas, por lo que la adición de incluso una
pequeña cantidad de muestra se detecta fácilmente.
Las
ventajas de los TCD son la facilidad y simplicidad de uso, la amplia aplicación
de los dispositivos a compuestos orgánicos e inorgánicos y la capacidad del
analito para recolectarse después de la separación y detección. El mayor
inconveniente del TCD es la baja sensibilidad del instrumento en relación con
otros métodos de detección, además de la dependencia del caudal y la
concentración.
Figura
5:
Esquema de un detector TCD
Algunos ejemplos resueltos en:
https://www.calameo.com/books/0062545108a6fc9acfbd5
https://es.scribd.com/document/381167241/PROBLEMASCROMATOGRAFIA
https://fcf.unse.edu.ar/archivos/series-didacticas/SD-44-Cromatografia-CORZO.pdf
Ejercicios :
https://www.surcosistemas.com.ar/virtual/ebooks/QUIMICA_ANALITICA_Novena_edicion.pdf
Hubschmann, H. (2001). Handbook of GC/MS: Fundamentals and Applications. Alemania: Wiley-VCH Verlag.
Krugers, J. (1968). Instrumentation
in Gas Chromatography. Netherlands: Centrex Publishing Company-Eindhoven.
LibreTexts Chemistry. (2016). Chromatography.
Recuperado el 14 de Mayo de 2024, de LibreTexts Chemistry:
https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Analytical_Chemistry/Supplemental_Modules_(Analytical_Chemistry)/Instrumentation_and_Analysis/Chromatography/Chromatography
McNally , M., & Usher, K.
(2015). Precision of Internal Standard and External Standard Methods in
High Performance Liquid Chromatography. Recuperado el 14 de Mayo de 2024, de https://www.chromatographyonline.com/view/precision-internal-standard-and-external-standard-methods-high-performance-liquid-chromatography
Scion instruments. (2023). Internal
Standards - What Are They? How Do I Choose, Use and Benefit From Them? Recuperado el 14 de Mayo de 2024, de
https://scioninstruments.com/us/blog/internal-standards-what-are-they-how-do-i-choose-use-and-benefit-from-them/
Scott, R. (1996). Chromatographic
Detectors: Design, Function, and Operation. USA: Marcel Dekker, Inc.
Skoog, D., Holler, F., & Crouch,
S. (2007). Principles of Instrumental Analysis. USA: Thomson
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Thet, K., & Woo, N. (2013). LibreTexts Chemistry. Recuperado el 14 de Mayo de 2024, de Gas Chromatography: https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Analytical_Chemistry/Supplemental_Modules_(Analytical_Chemistry)/Instrumentation_and_Analysis/Chromatography/Gas_Chromatography
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